Métodos Alternativos In Vitro: Una creciente tendencia en crecimiento para la evaluación de la seguridad a nivel regulatorio

Co-autoría de Rahul Date, Ph.D., Jefe – Sección R & D; Rajendra Nagne, Ph.D., Jefe – Sección de Mutagenicidad; Manish Patel, Ph.D., Jefe – Toxicología. 

Los pesticidas han controlado y reducido las enfermedades en las plantas, además de aumentar la producción, aunque también pueden dar a lugar a efectos adversos. Como consecuencia de ello, se necesita una batería de ensayos toxicológicos que permitan una evaluación constante y precisa de los riesgos que puedan conllevar, en especial en el caso de usos prolongados. Gran parte de la metodología tradicional se fundamenta en estudios con animales, pero dicha aproximación debe ser sustituida con ensayos alternativos que sean fiables y que permitan seguir evaluando la seguridad de los pesticidas y respetandoel bienestar de los animales y otras consideraciones éticas.
 

JRF ha estado ofreciendo ensayos GLP in vitro a sus clientes en todo el mundo desde 2013. Ello nos ha permitido monitorizar el desarrollo regulatorio e ir actualizando los estudios en base a los avances tecnológicos y nuevas directivas en esta área en base a la experiencia. 
 

Nuestro compromiso con los principios 3R para el desarrollo de ensayos sin animales es absoluto. Algunos de estos ensayos alternativos sirven para sustituir ensayos en animales; otros ayudan a reducir la cantidad de animales necesarios en un ensayo, y otros, a mejorar los procesos en los ensayos para disminuir el dolor y el sufrimiento. JRF ofrece estos estudios de acuerdo con las exigencias de las diferentes autoridades regulatorias del mundo. La metodología de los ensayos in vitro en general se basa en el uso de tejidos reconstituidos, células enteras o partes de células. 
 

Los recientes avances en investigación celular incluyen el desarrollo bidimensional y tridimensional de (co)-cultivos de células, que imitan de manera muy cercana a los tejidos del cuerpo humano.

 

Listado de ensayos alternativos (in vitro)     
 

1. Cinética de penetración dermal de un producto en piel humana
 

Este ensayo evalúa cuantitativamente el potencial de absorción y penetración cinética de la formulación que se quiere analizar.
 

La directriz relevante de este ensayo está recogida en la guía OECD 428. Este ensayo ha recibido un gran ímpetu en el pasado reciente, debido a la prohibición del uso de animales, en conformidad con la guía OECD 427.
 

JRF ofrece soporte durante la fase de desarrollo mediante el screening de los distintos productos candidatos. También realizamos estudios utilizando piel dermatoma humana y piel de ratones. El producto en desarrollo a analizar puede ser un compuesto radioactivo o frío. La cuantificación de la penetración dermal en el caso del compuesto radioactivo es mediante un analizador líquido de centelleo durante el estudio cinético. Los compuestos fríos son analizados a través de sofisticados métodos de LC-MS/MS en los que se cuantifica la presencia del ingrediente activo.

2. Ensayos de corrosión e irritación dermal   
 

Estos estudios han remplazado los ensayos convencionales de irritación dermal en roedores.
 

Corrosión dermal OECD TG 431
 

El estudio de corrosión dermal se lleva a cabo en Epidermis humana Reconstituida (RhE), que implica el uso de queratinocitos epidérmicos derivados de humanos. Dichos queratinocitos se han cultivado formando un modelo de epidermis humana de múltiples capas y altamente diferenciado, que incluye una capa basal, una capa espinosa y una capa granular organizada, así como un stratum corneum multicapa con lípidos intercelulares lamelares análogos de las principales clases de lípidos encontrados in vivo.
 

La corrosión se mide usando tejido RhE para determinar si la exposición a la sustancia, puede causar potenciales daños irreparables visibles como la necrosis. La viabilidad celular se mide usando un tinte vital como el MTT, que permite discriminar entre células vivas y muertas.

 

Irritación dermal OECD 439  
 

Las irritaciones dermales son resultado de respuestas en forma de eritemas y edemas.
 

Este ensayo determina los eventos que conducen a los queratinocitos moribundos a liberar mediadores que inicien la cascada inflamatoria. Este proceso tiene lugar en las células de la dermis, particularmente las del estroma y del endotelio.

Este ensayo también se lleva a cabo usando tejido humano epitelial reconstituido. La dilatación y permeabilidad aumentada de las células endoteliales son las que producen los edemas y eritemas observados. La liberación del contenido celular como resultado de los efectos adversos que conducen a la irritación de la piel, es medido por la conversión enzimática del colorante vital MTT[3-(4,5 – Di-methylthiazol - 2-yl)2-5-diphenyltetrazolium bromuro, Thiazolyl azul] a cristales de formazan de color azul. Mediante una extracción de los cristales de los tejidos, se puede cuantificar el proceso por espectrometría basada en la densidad óptica (DO) del sobrenadante clarificado. Los productos irritantes se identifican por su habilidad de disminuir la viabilidad de las células por debajo de los niveles límites definidos, i.e. ≤ 50%.  
 

3. Sensibilización de la piel
 

En apoyo al desarrollo de producto, JRF ofrece tres ensayos escalonados in vitro de sensibilización de la piel y con base al principio AOP – Adverse Outcome Pathway-. Este paquete de ensayos eliminan las formulaciones  que puedan causar una posible sensibilización de la piel.
 

La respuesta relacionada con el AOP es claramente evaluada en base al pictograma (Fig. 1) que se muestra a continuación sobre la sensibilización de la piel.

Este pictograma clasifica la respuesta a la sensibilización impulsada por los siguientes sucesos:

1. Evento de iniciación molecular (MIE) focalizada en la reactividad péptica

2. Respuesta celular con queratinocitos

3. Respuesta celular dendrítica 
 

Estos ensayos son in vitro y tienen como objetivo reemplazar al “Local Lymph Node Assay”, un test que analiza la respuesta del organismo del conejillos de India a compuestos identificados como sensibilizadores.
 

Sin embargo, si los compuestos son identificados como no sensibilizadores el LLNA debe ser llevado a cabo después de obtener autorización del organismo regulador.
 

Seguidemane revisaremos los ensayos de sensibilización in vitro más relevante.

A. Ensayo de Reactivación Péptica Directa (DPRA) y Foto DPRA (OECD TG 442C):   
      

Estos ensayos evalúan el potencial de sensibilización como resultado de la reducción de los hepta-péptidos sintéticos de lisina y cisteína. La haptenización es el nombre que recibe el enlace covalente de moléculas de bajo peso molecular (hapten) con proteínas en la piel. Está considerado el mecanismo prominente a través del cual las substancias pueden volverse antigénicas. Consecuentemente, ensayos de reactivación de péptidos como el ensayo DPR, están considerados como relevantes para la evaluación del potencial de sensibilización del producto. 
 

Se deben tener en cuenta varias limitaciones: No puede utilizarse para mezclas, compuestos naturales (cuando la relación molar del hepta-péptido no puede ser testada), compuestos de baja solubilidad, aldehídos, o compuestos que facilitan la dimerización de la cisteína, entre otros).  
 

B. KeratinoSens™ Assay (OECD TG 442D):   
 

Este test se fundamenta en la activación de los queratinocitos –células adherentes inmortalizadas derivadas de queratinocitos humanos HaCaT obtenidos de células transfectadas con un plásmido seleccionable.El linaje celular contiene el gen de la luciferasa bajo el control transcripcional de un promotor constituyente, que está fusionado con un elemento ARE de un gen del cual sabemos que puede ser aumentado en contacto con sustancias sensibilizadoras. La presencia de la Luciferasa puede ser medida en un aparato medidor de Quimioluminiscencia. Esta reacción permite la medición (por detección lumínica) cuantitativa del gen inductor de luciferasa utilizando substratos de luciferasa bien conocidos, productores de luz, como un indicador de la actividad del factor Nrf2 de transcripción en células que han sido expuestas a sustancias electrofílicas. 

Consejos
 

- El nivel conclusivo máximo debe ser de 2.000 uM. Se puede trabajar con 1.000 uM pero un resultado negativo no puede ser conclusivo.

- No puede ser usado en compuestos hidrófobos o que tengan un LogP superior a 6.

- No se pueden analizar sustancias altamente citotóxicas.
 

C. Ensayo de Activacion de Linajes de Células Humanas (h-CLAT) (OECD 442E)    
 

El método h-CLAT es un ensayo in vitro que cuantifica los cambios en la expresión de marcadores celulares en superficie (i.e., CD86y CD 54) en la línea celular humana de leucemia monocitica THP-1, pasadas las 24 horas de exposición al producto químico. Estas moléculas superficiales son marcadores típicos de activación de monocitosTHP1 e imita la activación de células dendríticas (CD) que juega un papel fundamental en el cebado de células T. Los cambios en la expresión de los marcadores de superficie, son medidos por citometría de flujo, que analiza la tinción de células mediante anticuerpos marcados con un fluorocromo. Las mediciones citotóxicas se llevan a cabo simultáneamente para evaluar si un aumento en la expresión de los marcadores de superficie también ocurre en concentraciones sub-citotóxicas.
 

La intensidad fluorescente relativa de los marcadores de superficie versus el control vehículo-solvente, son calculados y usados en el modelo predictivo que discrimina entre sustancias sensibilizadoras y no sensibilizadoras.  

 

- Los resultados negativos con sustancias químicas con Low Kow superior a 3,5 deben ser descartados. Sin embargo, resultados positivos obtenidos con sustancias químicas con un Low Kow mayor a 3,5 pueden ser usados para clasificar un producto químico como sensibilizador de piel.

-  No se puede analizar compuestos que interfieren con el espectro de fluorescencia sobreponiéndose a los FITC/PI.
 

JRF está totalmente comprometida con la reducción en la utilización de animales y continuaremos validando nuevos ensayos in vitro. JRF fue uno de los primeros laboratorios en la región que validó cuidadosamente los actuales ensayos in vitro y puede ofrecer una completa relación de ensayos in vitro para diversas empresas.